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isothiocyanate de fluorescéine , communément appelé FITC - prononcez « Fit- c ", pour rimer avec " écervelé " - est un marqueur fluorescent qui est chimiquement lié ou conjugué à d'autres molécules telles que les protéines et les anticorps. Un anticorps conjugué avec FITC peut aussi être considéré comme un "anticorps marqué au FITC . " FITC est excité par la lumière à une longueur d'onde de 488 nm et émet fluorescente énergie détectée à 530 nm . Un scientifique peut le voir avec un microscope ou utiliser un équipement fluorescent qui détecte les émissions et les enregistre fluorescentes. Méthodes
FITC conjugaison suit un protocole de base. Par exemple, la FITC et un anticorps seraient mélangés à une certaine proportion dans un tube à essai et de rotation à température ambiante pendant une heure . Pour retirer le FITC non liée de la solution , il est versé sur une colonne de chromatographie d'affinité - un tube de verre rempli d'un gel de bourrelet qui liera le FITC non conjugué . Pendant ce temps, l'anticorps marqué au FITC circulera à travers la colonne et est recueillie à l'emploi.
Considérations
Avant de commencer une conjugaison, le chercheur doit tenir compte de plusieurs points. Tout d'abord, FITC est très instable et ne doit pas être exposé à la lumière - il doit être conservé dans du papier couvertes de tubes en tout temps. Deuxièmement, le temps de conjugaison et la température peuvent être modifiées pour une protéine sensible à la température . Enfin, différentes protéines et les anticorps peuvent avoir différentes capacités FITC - contraignants , afin de trouver le bon ratio d'anticorps anti- FITC est critique , trop peu FITC rend un anticorps indétectables et trop peut altérer sa spécificité. Pour cette raison, conjugaisons préliminaires à petite échelle à différents rapports de FITC à l'anticorps devraient être mis en place en parallèle. Une fois le rapport optimal est établi , la conjugaison à grande échelle peut être effectuée.
Utilise
médecins et les scientifiques utilisent des anticorps marqués au FITC , les hormones et la croissance facteurs dans une grande variété de tests et d'applications. Par exemple, une cellule souche dans le sang a une molécule sur sa surface appelée CD34. Un technicien de laboratoire peut mélanger le sang d'un patient avec un anticorps marqué au FITC spécifique pour CD34, et exécuter les cellules à travers un cytomètre de flux qui utilise un faisceau laser pour faire le FITC fluorescence . Ensuite, le cytomètre sépare les cellules fluorescentes CD34 du reste des cellules du sang, et les médecins peuvent utiliser ces cellules souches isolées pour des traitements thérapeutiques .
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